如何传代贴壁细胞？
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化贴壁细胞成单个细胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一种二价离子的螯合剂，能抑制细胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的细胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca2+和Mg2+的盐溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗细胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后弃去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask)，观察细胞直到细胞变圆脱离瓶壁，此过程一般需要5-15分钟，为了避免细胞成团，消化细胞的过程中不要拍打细胞瓶。对于特别难消化的细胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把细胞置于37°C 促进消化，细胞脱离瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培养基中止消化，血清中某些蛋白质能够抑制胰酶的活性。
一般情况下，离心并不需要。如果细胞需要无血清或者低血清的培养基，可以以125000g 转速离心5分钟，然后弃去中止用的培养基，加入适合的新的培养基轻轻混匀细胞，移入到新的培养瓶。传代的比例视细胞类型而定，一般是1:2-1:20，具体比例可参考说明书。胰蛋白酶会对某些细胞的细胞膜产生损伤，对于这种类型的细胞，可用细胞刮轻轻刮下细胞，加入适量的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后进行传代培养。

传代细胞的频率多久较合适？
 传代是指把细胞从一个培养瓶移到另一个培养瓶，传代的间隔是指两次传代之间的时间。
贴壁型的细胞的汇合度达到或者接近100%的时候，需进行
传代操作，但是，有些细胞以克隆的形式生长，汇合度永远达不到100%，对于这种类型的细胞，细胞达到或者接近最大密度的时候，就需传代。接触抑制型细胞（比如3T3）需要在细胞长满之前传代以避免产生细胞长满后接触抑制后产生性状的改变。悬浮型的细胞必须在细胞达到最大饱和密度之前传代，悬浮细胞传代时只需稀释至合适的密度，让细胞有充足的营养恢复到对数生长期。

如果仅仅是简单的换液，而且细胞数量不减少，细胞将会快速耗尽营养而死亡；如果细胞稀释到最低密度之下，细胞将会进入停滞期而不增殖或者死亡。不同的悬浮细胞的最大饱和密度和传代的间隔与比例是不同的，所以，培养悬浮细胞要每日观察。

 如何处理对于生物安全性不清楚地肿瘤细胞株？ 
了解每株细胞可能产生的生物危害是很难的，但是强烈推荐，所有的人类和其他灵长类生物的细胞在能否预防HIV和肝炎病毒的实验条件下操作，所有的操作必须在垂直层流超净台内操作（推荐生物安全柜），操作过程中产生的废液和废仪器都要经过清洗、酸处理等处理后才能丢弃。

细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？
不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：
（1）０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ；
（2）０.２５％胰蛋白酶＋０.０３％ＥＤＴＡ。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制。  
多数细胞传代消化可使用０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ这种消化液。  

细胞株的污染鉴定、预防和处理问题。
普通微生物污染：培养基浑浊，高倍镜观察有微生物污染；按规定弃用并全面严格灭菌。

支原体污染：显微镜无法观察，依经验表现为细胞生长缓慢，有细胞漂浮等等，应通过PCR 等方法鉴定，如发现支原体污染，应按规定弃用，实验室要及时全面消毒灭菌，防止蔓延。（有些常规性细胞学实验不受支原体污染影响，可以继续使用细胞传代，为防污染扩大蔓延，可以选择性的在培养基中加入高效价的其它种抗生素，并在隔离实验室操作和独立使用一切用具与培养基等）。

支原体污染及检测：  
（1）支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器。  
目前通过对国内100余株/系细胞的检测，形势不容乐观。污染率达30% ~ 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。  
（2）支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。目前，支原体检测的方法有以下几种。  
a）相差显微镜观察； 
b）.低张处理地衣红染色法；  
c）荧光染色法； 
d）酶标法；  
e）PCR法：使用该方法进行检测。  
优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小  （只需50ul细胞培养用液上清）。  
缺点：引物及制剂费用较高。